Romano Guardini wurde am 17. Februar 1885, als Sohn des Geflügelgroßhändlers Romano Tullo und dessen aus Südtirol stammenden Frau Paola Maria, in Verona geboren. Bereits im darauffolgendem Jahr siedelt Guardini gemeinsam mit seinen Eltern und seinen drei Brüdern nach Mainz über. Ab 1891 besuchte Guardinidie Volksschule und nach deren Abschluss das Humanistische Gymnasium in Mainz. Am 07. August 1903 beendete Guardini letzteres mit der Reifeprüfung.
Im Wintersemester 1903 begann Guardini ein Studium der Chemie an der Universität in Tübingen, welches er jedoch nach zwei Semestern abbrach. Bereits im darauffolgendem Wintersemester des Jahres 1904 begann er ein Studium der Nationalökonomie an der Universität in München und wechselte nach zwei Semestern, zum Wintersemester 1905, an die Universität nach Berlin um sein Nationalökonomie-Studium fortzusetzen. Jedoch auch diesees brach er nach einem Semester ab. Mit Beginn des Sommersemesters 1906 wechselte Guardini für drei Semester zum Studium der Theologie nach Freiburg i.Br. (drei Semester) und setzte mit dem Wintersemester 1907 das Theologiestudium in Tübingen fort. Während dieser drei Semester besuchte er unter anderem Vorlesungen bei dem Dogmatiker Wilhelm Koch und in dieser Zeit begann die Freundschaft mit Josef Weiger. In den Jahren von 1907 bis 1908 hatte Guardini seine erste Begegnung mit der Liturgie der Benediktiner in Beuron und im Wintersemester des Jahres 1908 trat er in das Priesterseminar in Mainz ein.
Am 28. Mai 1910 erhielt Romano Guardini durch den Bischof Georg Heinrich Kirstein die Priesterweihe in Mainz.
Als Kaplan war Guardini vom 01. Juli 1910 in Heppenheim in der Bergstraße, von wo aus er am 27. Mai 1911 an das Krankenhaus in Darmstadt und am 01. August 1911 in die Dompfarrei nach Worms ging. Guardini nahm als einziger der Familie, und gegen deren Willen, am 11. August 1911 die deutsche Staatsangehörigkeit an, um Religionsunterricht erteilen zu können. Am 16. April 1912 war Guardini Kaplan in Mainz im St. Christoph und wurde am 01. Oktober 1912 beurlaubt, um sein Studium in Freiburg fortzusetzen. Guardini wohnte im "Collegium Sapientiae" und zu seinen Kommilitonen gehörten Joseph Frings und Martin Heidegger. Am 15. Juni 1913 starb Josefine Schleußner, mit dessen Ehemann Wilhelm Schleußner reiste Guardini nach Neiße, wo er mit Bernhard Strehler zusammentraf.
Am 14. Mai 1915 erhält der dreißigjährige Guardini seine Promotion zum Dr. theol. in Freiburg i.Br. bei Carl Braig über "Die Lehre des hl. Bonaventura von der Erlösung. Ein Beitrag zur Geschichte und zum System der Erlösungslehre." (gedruckt 1921/22) Am 20. Mai 1915 war Guardini als Kaplan in Mainz im St. Ignaz und in den Jahren von 1915 bis 1920 hatte Guardini die Leitung des Schülerbundes Juventus, einer Vereinigung katholischer Gymnasiasten in Mainz, inne. "Juventus" wurde später zu einer "Akademie". Ab dem 01. Februar 1916 war er als Kaplan in Mainz im St. Emmeran und ab 21. August 1916 im Mainzer St. Peter. Von 1916 bis 1918 absolvierte Guardini seinen Militärdienst als Krankenwärter.
Im Jahre 1918 hat Guardini erstmalig Verbindung mit der Abtei Maria Laach. Ebenfalls 1918 wird Guardinis Werk "Vom Geist der Liturgie" als erstes Bändchen der Laacher Reihe "Ecclesia orans" veröffentlicht. Nach dem Tode seines Vaters löst Guardini 1919 die elterliche Wohnung in Mainz auf und seine Mutter kehrte nach Italien zurück.
Am 13. April 1920 wird Guardini wegen seiner Habilitation in Bonn beurlaubt und auf Einladung Hermann Hoffmanns macht er Ostern, anlässlich des zweiten deutschen Treffens, die Bekanntschaft mit der katholischen Jugendbewegung "Quickborn" auf Burg Rothenfels am Main. Hier begegnet er unter anderem Josef Pieper, Heinrich Kahlefeld und Walter Dirks. Ebenfalls 1920 war Guardini Hausgeistlicher im Institut Sacré-Coeur in Pützchen bei Beuel am Rhein und im Kloster St. Adelheid, und übernahm dann die Betreuung der zur Pfarrei Küdinghoven gehörigen Expositur Niederholtdorf (Siebengebirge bei Bonn).
1922 erhält Guardini seine Habilitation für katholische Dogmatik an der Universität in Bonn, das Thema seiner Habilitationsschrift "Die Lehre vom lumen mentis, von der gradatio entium und von der influentia sensus et motus und ihre Bedeutung für den Aufbau des Systems Bonaventuras". 1922 wurde Guardini Privatdozent für Systematische Theologie an der Katholisch-Theologischen Fakultät der Universität Bonn. Hier begegnete er Martin Buber und auf der Bonner Tagung des Katholischen Akademikerverbandes hielt er den Vortragszyklus "Vom Sinn der Kirche".
Am 11. April 1923 folgte Guardini dem Ruf des Preußischen Kultusminister Carl Becker auf den neu errichteten Lehrstuhl für "Religionsphilosophie und Katholische Weltanschauung" an der "preußisch-protestantischen" Universität Berlin. Aus eher organisatorischen Gründen wurde Guardini Mitglied der Katholisch-Theologischen Fakultät der Universität Breslau mit der Verpflichtung, als ständiger Gast an der Universität Berlin zu lesen.
1923 arbeitete Walter Dirks als Sekretär bei Guardini in Potsdam. Noch im gleichen Jahr wechselte Dirks auf Empfehlung Guardinis gegenüber dem Herausgeber Friedrich Dessauer und als Folge seiner aufsehenerregenden Serie von Artikeln in den Zeitschriften der katholischen Jugendbewegung über den Ruhrkampf beruflich nach Frankfurt, wo er bis 1934 Redakteur der linkskatholischen Rhein-Mainischen Volkszeitung war. Ebenfalls in diesem Jahr traf Guardini mit Rudolf Schwarz, Felix Messerschmid und Dieter Sattler zusammen.
1924 wurde Guardini Mitherausgeber der 1920 von Josef Aussem, seit 1924 geistiger Mittelpunkt des "Quickborn", gegründeten "Quickborn"-Zeitschrift "Die Schildgenossen". Im darauffolgendem Jahr begegnete der vierzigjährige Guardini Eugen Jochum, und wurde später Taufpate der Jochum-Tochter Romana.
1925 verunglückte Karl Neundörfer tödlich in den Bergen. Ab 1927 übernahm Guardini die Mittwoch-Messe in der Sozialen Frauenschule in Berlin und war ebenfalls ab diesem Jahr Bundesleiter des "Quickborn" und Leiter von Burg Rothenfels am Main. In den Jahren von 1928 bis 1943 übernahm Guardini die Gestaltung des sonntäglichen Studentengottesdienstes in Berlin im St. Benedikt und 1931 hielt Guardini einen Vortrag auf den ersten Salzburger Hochschulwochen.
1935 erhielt Guardini zum 50. Geburtstag die Festschrift "Christliche Verwirklichung" (hrsg. von Karlheinz Schmidthüs) und 1936 baut Rudolf Schwarz für Guardini in Berlin-Schlachtensee dessen erstes Haus, das dieser nach verschiedenen Wohnungen in Potsdam und Berlin 1936 bezieht. 1937 erscheint die erste Buchauflage von "Der Herr. Betrachtungen über die Person und das Leben Jesu Christi" nach vorhergehenden Einzellieferungen unter dem Titel "Aus dem Leben des Herrn" die bereits von 1933 bis 1934 erschienen waren.
In den Jahren von 1939 bis 1943 hält Guardini Vorträge an der Katholischen Volkshochschule in Berlin. Am 11. März 1939 folgt Guardinis Zwangsemeritierung nach Aufhebung des Lehrstuhls in Berlin. Guardini hält Abendvorträge in Berlin im St. Canisius und noch im selben Jahr wird die Arbeit auf Burg Rothenfels verboten und die Burg durch die Nationalsozialisten konfisziert. Es folgt 1941 das Verbot der Zeitschrift "Die Schildgenossen" verbunden mit einem Redeverbot für Romano Guardini. Trotz des Redeverbots hält Guardini 1943 in Greifswald die eindrucksvolle Vortragsreihe über "Freiheit, Gnade, Schicksal". In den Jahren von 1943 bis 45 hält er sich bei seinem Freund Josef Weiger, der Pfarrer in Mooshausen im schwäbischen Allgäu ist, auf. Hier findet er einen neuen Freundeskreis um Joseph Bernhart, der Kapuzinerpater Manfred Hörhammer. Guardinis autobiographische Aufzeichnungen entstehen ebenfalls in Mooshausen.
1944 besucht Guardini erstmals seit 1923 Mainz und beendet am 06. März 1945 die autobiographischen Aufzeichnungen. 1945 folgt Guardini der Berufung auf den Lehrstuhl ad personam für "Religionsphilosophie und Christliche Weltanschauung" an der Universität Tübingen durch den Württembergischen Kultusminister Carlo Schmid. Romano Guardini würdigte die Mitglieder der "Weißen Rose" und vor allem Hans und Sophie Scholl bei einer Gedenkstunde an der Münchener Universität am 4. November 1945 mit den Worten: "So standen sie im Raum des Glaubens ... so haben sie für die Freiheit des Geistes und die Ehre des Menschen gekämpft, und ihr Name wird mit diesem Kampf verbunden bleiben."
In den Jahren von 1948 bis 1962 ist Guardini Inhaber des gleichnamigen Lehrstuhls an der Philosophischen Fakultät der Universität München. Hier traf er unter anderem Michael Schmaus, Theoderich Kampmann und nicht zuletzt Ernst Tewes. Guardini predigte an der Münchener Universitätskirche St. Ludwig (sonntags um 11 Uhr). Ein Teil seiner Predigten ist in den Jahren von 1956 bis 1959 unter dem Titel "Wahrheit und Ordnung" in 33 Heften erschienen. 1950 erscheint die Veröffentlichung der Psalmen-Übersetzung "Deutscher Psalter" (im Auftrag der deutschen Bischöfe).
1952 erhielt Guardini den Friedenspreis des deutschen Buchhandels (als 3. Preisträger überhaupt) und wurde zum Päpstlichen Hausprälaten ernannt. Ebenfalls in diesem Jahr eröffnet Guardini den Berliner Katholikentag mit der bezeichnenden Rede "Nur wer Gott kennt, kennt den Menschen". 1954 wurde Guardini die Ehrendoktorwürde der Philosophischen Fakultät der Universität Freiburg i.Br. verliehen und 1955 eine Goldene Ehrenmünze der Stadt München geprägt. 1956 wurde Guardini zum Ehrenbürger von Verona ernannt.
Am 1. Februar 1957 hielt Guardini den richtungweisenden Festvortrag über "Kultur als Werk und Gefährdung" beim Gründungsakt der Katholischen Akademie in Bayern in der Großen Aula der Ludwig-Maximilian-Universität München. 1958 erhielt Guardini den Bayerischer Verdienstorden und wurde Mitglied der Friedensklasse des Ordens "Pour le Mérite". Im darauffolgendem Jahr erhielt er das Große Verdienstkreuz der Bundesrepublik Deutschland. 1961 wurde Guardini zum Mitglied der liturgischen Vorbereitungskommission für das Zweite Vatikanische Konzil ernannt und 1962 wurde ihm der Erasmuspreis in Brüssel durch Z.K.H. Bernhard, Prinz der Niederlande verliehen. Zu Beginn des Wintersemesters 1962 beendet Guardini seine Vorlesungstätigkeit an der Universität München aus gesundheitlichen Gründen.
In den folgenden Jahren erhielt Romano Guardini zahlreiche Auszeichnungen, wie 1963 den San Zeno Preis der Stadt Verona und 1963 wurde er zum Ehrenbürger von Isola Vicentina, dem Wohnsitz der Familie Guardini ernannt. Von 1964 bis 1967 übernahm Prof. Dr. Karl Rahner SJ den "Romano-Guardini-Lehrstuhl".
Drei Jahre vor seinem Tod bot ihm Papst Paul VI einen Kardinalshut an, den er allerdings ablehnte. 1965 erhielt Guardini das Große Verdienstkreuz mit Stern der Bundesrepublik Deutschland. Im selben Jahr wurde ihm die Ehrendoktorwürde der Universität Padua verliehen und durch die Stadt München wurde er mit der Medaille "München leuchtet" in Gold geehrt. 1965 fand anlässlich seines 80. Geburtstags ein Festakt an der Universität München statt, während dem ihm die Festschrift "Interpretation der Welt" (hrsg. von Helmut Kuhn, Heinrich Kahlefeld und Karl Forster) überreicht wurde.
1968 unternahm Guardini zusammen mit Frau Maria Parzinger, Frau Clara Chrzanowiski und seinem Arzt Dr. Franz Riedweg seine letzte Italienreise zum Familiensitz auf die Isola Vicentina.
Romano Guardini starb am 01.Oktober 1968, im Alter von 83 Jahren, in München und am 04. Oktober 1968 fand das Requiem in St. Ludwig mit Predigt von Julius Kardinal Döpfner und dem Begräbnis auf dem Priesterfriedhof des Oratoriums des Hl. Philipp Neri in München, St. Laurentius statt.